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Ampicillin (Molekularbiologie) Ampicillin (D [-] - a-aminobenzylpenicillin, Fig. 1) ist ein Mitglied einer wachsenden Familie von antimikrobiellen Mitteln wie die semisynthetischen Penicilline bekannt. Die halbsynthetischen Penicilline sind Derivate des Naturprodukts, 6-aminopencillanic Säure, die absichtlich chemisch modifiziert wurden (1). Die chemischen Modifikationen werden eingeführt, um neue Verbindungen mit bestimmten wünschenswerten Eigenschaften erstellen. Im Falle von Ampicillin, die Zugabe der aminobenzyl Seitenkette führt zu einem Produkt mit einer erhöhten Resistenz gegenüber sauren pH-Wert. Somit ist Ampicillin medizinisch bedeutsam, weil es das erste Penicillin war in chemotherapeutischen Praxis oral verabreicht werden. Darüber hinaus zeigt Ampicillin ein breiteres antibakterielles Spektrum als die natürlich vorkommenden Penicilline tun und ist wirksam gegen viele Gram-negative Bakterienspezies. Die äußere Membrankomponente der Gram-negativen bakteriellen Zellwand stellt eine Permeabilitätsbarriere gegen viele Antibiotika, einschließlich der natürlichen Penicilline (2). Das breite Wirkungsspektrum und die relativ geringen Kosten von Ampicillin haben sie ein unschätzbares Werkzeug in der Molekularbiologie und Genetik zur Untersuchung von Gram-negative Modellorganismen, wie Escherichia coli und Haemophilus influenzae gemacht. Anwendungen, die Ampicillin verwenden, sind unten zusammengefasst. Abbildung 1. Struktur von Ampicillin. Die erste Anwendung von Penicillin in genetics war für die Auswahl von auxotrophen Mutanten von E. coli (3, 4). Diese Technik, die Penicillin-Auswahl wurde auf der Tatsache, dass Penicillin nur aktiv wachsenden Bakterien tötet, während nicht wachsenden Bakterien Penicillin-tolerant (siehe Penizillin) sind. Obwohl Benzylpenicillin (Penicillin G) in den ursprünglichen Studien verwendet wurde diese Technik beschreibt, würde Ampicillin für diesen Zweck weit effektiver sein wegen seines breiten Spektrums. Molekularbiologen haben ausgiebig genetische Elemente kodieren, b-Lactamase (siehe Penicillin-bindende Proteine), insbesondere das Enzym bezeichnet TEM-1 genutzt werden. TEM-1 ist ein breites Spektrum b-Lactamase, die eine effektive hohe Resistenz gegen Penicilline (5) verleiht. Die codierende Gen TEM-1 wurde in das erste Plasmid-Klonierungsvektoren eingebaut (6) und da in Klonierungsvektoren wurde weit verbreitet. Ampicillin wurde routinemäßig für die Selektion und Aufrechterhaltung von Bakterien tragenden rekombinanten Plasmide kodieren, b-Lactamase, und dies ist zweifellos seine häufigste Anwendung in der Molekularbiologie verwendet werden. Zu diesem Zweck wird Ampicillin in bakteriologischen Medien eingearbeitet in Endkonzentrationen im Bereich von etwa 50-100 | ig / mL. Für E. coli, sind diese Niveaus etwa 10-20 mal höher als die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von Ampicillin. Die MIC wird als die minimale Konzentration des Antibiotikums definiert, die notwendig ist, das Bakterienwachstum zu hemmen. Wenn eine Mischung aus Ampicillin-sensitiv und Ampicillin-resistente Bakterien auf festem Medium ausplattiert, die Ampicillin, beispielsweise zur Selektion von Transformanten, eine b-Lactamase-kodierten Plasmid tragen, ist es nicht ungewöhnlich große Kolonien von umgeben Ampicillin-resistente Bakterien gebildet zu finden durch eine Zone kleinerer Kolonien. Die Ampicillin-resistenten Bakterien in den großen zentralen Kolonien produzieren und b-Lactamase sekretieren. Die Aktivität der sekretierten b-Lactamase schafft eine Zone mit reduziertem Ampicillin-Konzentration um die resistenten Kolonien, und dies erlaubt es, die Ampicillin-empfindliche Bakterien in der Umgebung zu wachsen. Das anschließende Wachstum der Ampicillin-sensitive Bakterien führt zur Bildung der kleineren sogenannten Satelliten-Kolonien. Die Satelliten-Kolonien normalerweise nicht ein großes Hindernis in dieser Verfahren dar, da die gewünschten Ampicillin-resistenten Bakterien können leicht durch Ausstreichen auf einem Ampicillin enthaltenden Medium gereinigt werden. Jedoch kann das Problem der Satelliten-Koloniebildung durch Substituieren Carbenicillin minimiert werden, eine andere halbsynthetisches Penicillin (siehe Fig 1 in Penicillin.) Für Ampicillin - in dem Selektionsmedium in einer Konzentration von 50100 | ig / ml (7). Carbenicillin ist weniger anfällig für Hydrolyse durch das b-Lactamase und ist daher weniger wahrscheinlich, Satellitenkoloniebildung zu fördern. Es wird deshalb oft anstelle von Ampicillin verwendet. Der b-Lactamase-Gen wurde auch in plaquebildende und fehlerhafte Derivate des E. coli-Bakteriophagen Mu (8) eingeführt. Diese Ampicillin-wählbare Phagen wurden für die Mutagenese und für den Bau von lac-Fusionen in Anwendungen eingesetzt, die die Vorteile der Fähigkeit von Mu nehmen zufällig umzusetzen. Das Konzept der Transposon-Mutagenese wurde auf transposable genetischen Elemente angewendet wurden, kodierend b-Lactamasen für die Erzeugung von Zufalls Genfusionen, die direkt auswählbar mit Ampicillin (oder Carbenicillin) sind. Zum Beispiel kann ein Derivat von Tn3 bezeichnet Tn3-HoHo1 (9) ein lacZ-enthaltenden Transposon der Lage, sowohl Transkriptions - und Translations-beta-Galactosidase-Fusionen zu erzeugen. Obwohl es ursprünglich für Studien über Agrobacterium tumefaciens entwickelt wurde, wurde es für die Verwendung in anderen Bakteriengattungen angepasst. B-Lactamase ist ein periplasmatische Enzym. Es hat sich für das Studium Protein den Export in die bakterielle Periplasma als wichtiges Modell diente. Urbain et al. (10) haben vor kurzem eine Technik zum Quantifizieren von b-Lactamase-Aktivität in Kulturen von E. coli tragende rekombinante Plasmide entwickelt, die Ampicillin-Resistenz verleihen. Ihre Assay involviert die Umwandlung von Ampicillin Bestimmung Säure in periplasmatischen Extrakten von Zellen, die durch quantitative Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf aminobenzylpenicilloic (HPLC). Das Verfahren kann zur Untersuchung des Mechanismus der b-Lactamase-Translokation nützlich sein. Es kann auch nützlich in Studien zur Proteinexpression nachzuweisen. Da beispielsweise b-Lactamase exprimiert konstitutiv aus Ampicillin-selektierbaren rekombinanten Plasmiden konnte seine Aktivität als ein nützliches interner Standard in Protein Koexpression Studien dienen. B-Lactamase wurde auch als genetisches Werkzeug zur Untersuchung von Membranproteinen verwendet worden, und diese Anwendungen basieren auf der Tatsache, dass b-Lactamase ist ein exportiertes Protein (11, 12). Ein Plasmidvektor, der die in-vitro-Konstruktion von Translationsfusionen zwischen einem Gen von Interesse ermöglicht, kodieren, die entweder ein Membranprotein oder ein exportiertes Protein und die reife Form (dh die exportierte Form) der TEM-b-Lactamase wurde beschrieben (13 ). Trans rekombinante Plasmide mit in-frame-Fusionen tragen, sind Ampicillin wählbar. Diese Technik kann für die Analyse von Protein-Exportsignale bzw. zur Ermittlung der topologischen Organisation von Membranproteinen verwendet werden. Eine Strategie zur Ausbeuten von Membran und exportierte Proteine basierend auf diesen Vektor zu maximieren, wurde ebenfalls beschrieben (14). Es ist bemerkenswert, daß der alkalischen Phosphatase wurde zur Untersuchung von Protein-Exportsignale und zur topologischen Abbildung von Membranproteinen (15) weit verbreitet. Der b-Lactamase-System ist eine attraktive Alternative zur alkalischen Phosphatase für diese Zwecke (13, 14) (Reporter Genes sehen). Sind beispielsweise b-Lactamase-Fusionen direkt wählbar (mit Ampicillin), während die Identifizierung der alkalischen Phosphatase-Fusionen auf phänotypischen Screening basiert. Außerdem werden nur die periplasmatischen Form der alkalischen Phosphatase ist enzymatisch aktiv, wobei sowohl die zytoplasmatische und periplasmatische Formen von b-Lactamase aktiv sind. Folglich kann die zelluläre Lokalisation der b-Lactamase-Fusionen auf der Grundlage des Gehalts an Ampicillin-Resistenz bestimmt werden; zytoplasmatischen b-Lactamase verleiht Ampicillin-Resistenz nur bei hoher Zelldichte, während periplasmatischen b-Lactamase-Ampicillin-Resistenz bei niedriger Zelldichte verleiht. Als Erweiterung dieser Studien, Broome-Smith et al. (16) eine transposable b-Lactamase Element ausgebildet sind, bezeichnet TnblaM, ist, dass in Höhe der transposable alkalische Phosphatase Element TnphoA. Die b-Lactamase-Fusionen mit TnblaM konstruiert sind direkt wählbar mit Ampicillin, und dies ist ein großer Vorteil gegenüber der alkalischen Phosphatase-System, das wie bereits auf phänotypischen Screening festgestellt, basiert.
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